CD Etude du long ARN non-codant ANRIL impliqué dans la modulation de la topologie nucléaire chez l'Homme

école doctorale

équipe

Equipe 1 : ARN, RNP (RNA/P)

contexte

I. Le long ARN non-codant ANRIL et contribution de l'équipe à la compréhension de son implication dans la modulation génique Chez l'Homme, le gène codant ANRIL (Antisense non-coding RNA in the INK4 locus ou CDKN2B-AS1) se localise dans la portion 21 du chromosome 9 (locus 9p21). Ce locus s'étend sur plus de 170 kb et comporte également les gènes CDKN2A, CDKN2B et ARF codant pour trois protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire notamment en favorisant l'arrêt du cycle en G1/S4. Ce locus 9p21 a initialement été identifié pour son association notamment au mélanome où il comporte des délétions variables incluant certaines régions exoniques ou promotrices d'ANRIL. Plusieurs études menées dans le cadre de Genome Wide Association Study (GWAS) ont étendu l'association d'ANRIL à bien d'autres pathologies telles que diabète, cancer, obésité, parodontite, glaucome et maladies cardiovasculaires. En 2020, Lou et coll. ont passé en revue l'expression d'ANRIL au sein de 31 tissus tumoraux et 31 tissus sains et ont mis en évidence un niveau d'expression d'ANRIL supérieur dans la majorité des tissus tumoraux. Une méta-analyse publiée en 2022, basée sur un échantillon de 1708 patients atteints de cancer extrait de 23 études issues de 3 bases de données, a également établi une corrélation claire entre une forte expression d'ANRIL, une survie globale défavorable, une taille tumorale plus importante, un stade TNM (Tumour, Node, Metastasis) avancé et la présence de métastases ganglionnaires. La forme la plus longue d'ANRIL (3834 nts) inclue 19 exons et ce nombre non négligeable d'exons induit la production par épissage alternatif d'au moins 28 isoformes linéaires pouvant être exprimés de manière tissu-spécifique11. Même si les fonctions de ces différents isoformes n'ont été que partiellement explorées, certains sont étroitement associés aux processus pathologiques. En particulier, plusieurs études sur cohortes ont permis de mettre en évidence une expression augmentée de 3 isoformes (NR_003529, EU741058, DQ485454) chez des patients atteints notamment d'athérosclérose. ANRIL régule négativement en cis l'expression des gènes CDKN2A et CDKN2B en favorisant le recrutement des Polycomb Repressive Complex 1 et 2 (PRC1/2) au locus 9p21. Ces complexes déposent des marques d'histone (H2AK119ub et H3K27me3 respectivement) conduisant à l'extinction transcriptionnelle des gènes CDKN2A et B15,16 (Fig.1). Outre cette activité cis, plusieurs études suggèrent qu'ANRIL module également l'expression de gènes localisés hors du locus 9p21 et ceci de façon directe. Il s'agit de l'activité qualifiée de trans (Fig.1). En effet, La surexpression de certains fragments d'ANRIL modifie l'expression de 927 gènes, impliqués dans le développement, l'adhésion, la prolifération et l'apoptose des cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney)13. Des expériences de RNA-FISH ont confirmé qu'ANRIL n'est pas limité au locus 9p2115. Plus récemment, une analyse transcriptomique a révélé que la déplétion de sa région 3' affecte l'expression de 3000 gènes dans les cellules musculaires lisses17. Figure 1 cf Projet PDF : Locus 9p21 et activités du lncRNA ANRIL. Le locus 9p21 contient plusieurs gènes dont les gènes CDKN2A, CDKN2B et ANRIL. CDKN2A et B codent pour des inhibiteurs de cyclines impliqués dans la régulation de la prolifération cellulaire. ANRIL code le lncRNA ANRIL. Ce dernier est capable de recruter des facteurs protéiques de type 'polycomb' (PRC1 et PRC2) responsables de la répression transcriptionnelle des gènes CDKN2A et B (activité -cis). Il est également susceptible de moduler l'expression de multiples gènes hors du locus 9p21 (activité -trans). Notons que le pouvoir régulateur d'ANRIL peut affecter de façon directe l'expression de certains gènes (cibles primaires), le produit de ces gènes pouvant avoir à leur tour un impact sur l'expression de multiples gènes (cibles secondaires). Bien qu'extrêmement intéressantes, les analyses décrites précédemment ne permettent pas de distinguer les cibles primaires des cibles secondaires. Il était donc important d'identifier les cibles primaires d'ANRIL afin de mieux comprendre les cascades de régulations opérées par ce dernier. Ainsi, en combinant de façon inédite les données d'occupation génomique d'ANRIL obtenues par ChIRP-seq (Chromatin Isolation by RNA Purification) avec des données de transcriptomique en condition de knock-down d'ANRIL dans les cellules HEK293, le groupe a établi une liste de 123 et 65 gènes dont l'expression est régulée négativement et positivement de manière directe par ANRIL respectivement (Fig.2). Nous démontrons également que l'exon 8 d'ANRIL joue un rôle crucial dans son association génomique, qu'il est impliqué dans la régulation de l'expression d'au moins 9 gènes parmi les 123 cibles primaires, via l'addition de H3K27me3 au niveau de leurs régions promotrices (Fig.2). De plus, l'équipe a généré des données qui suggèrent que le mode de reconnaissance par ANRIL de ses cibles génomiques implique des régions ADN composées majoritairement de résidus A et G. Globalement, ces données raffinaient les connaissances acquises pour l'activité trans d'ANRIL. Figure 2 cf Projet PDF : Contribution de l'équipe à la compréhension des activités d'ANRIL. Dans les cellules HEK293, ANRIL interagit avec 3 227 loci génomiques, majoritairement composés de résidus G et A. Il régule l'expression de 123 gènes à la baisse et de 65 gènes à la hausse. De plus, ANRIL influence l'épissage alternatif de 40 % de ses gènes cibles. Comme mentionnée précédemment, les lncRNAs pathogéniques ont de multiples activités dans la régulation génique et sont associées à la survenue ou au renforcement de maladies. ANRIL en est un exemple représentatif. Nous avons émis les hypothèses suivantes : - En conditions physiologiques, son taux d'expression est 'normal' et régule de façon appropriée un ensemble de gènes. - En conditions pathologiques, sa surexpression génère des molécules d'ANRIL excédentaires capables de renforcer l'activité régulatrice qu'il exerce sur ses cibles primaires voire sur des régions génomiques additionnelles (dysfonction pathologique). Les aberrations moléculaires ainsi générées pourraient être responsables de l'apparition et/ou du renforcement de processus pathologiques tels que les cancers. Sur la base de notre travail, nous avons pu conceptualiser une molécule compétitrice conçue pour bloquer, au moins en partie, les activités d'ANRIL. Cette molécule est couverte par un brevet européen étendu à l'international, publié le 25/05/2022 (Patent n° : US2024102009A1), et son développement progresse en vue d'un éventuel transfert. Ce projet a également fait l'objet de la soumission de 2 brevets déposés en 2024 (Projets TITAN et HUNTER). II. Données préliminaires et hypothèses de travail II.1 ANRIL et topologie nucléaire L'organisation 3D du génome joue un rôle clé dans la régulation de l'expression génique, et sa perturbation peut conduire à des processus pathologiques, notamment les cancers. Les chromosomes sont répartis en territoires chromosomiques, eux-mêmes organisés en deux compartiments chromatiniens : le compartiment A, riche en gènes actifs, et le compartiment B, enrichi en chromatine répressive. À l'échelle de plusieurs dizaines ou centaines de kilobases, des interactions préférentielles s'établissent à l'intérieur de domaines, limitant fortement leur connexion avec les régions voisines20 (Fig.3). Ces structures, appelées domaines topologiquement associés (TAD), regroupent des gènes souvent corégulés. Ces derniers contiennent des boucles chromatiniennes qui peuvent être classées selon deux types : les boucles promoteur-enhancer, qui activent l'expression génique, et les boucles promoteur-silencer, qui la répriment. L'équilibre entre ces interactions influence directement l'activité transcriptionnelle (Fig.3). Figure 3 cf Projet PDF : Organisation hiérarchique du génome. Les territoires chromosomiques, les compartiments A et B, les TAD et les boucles sont représentés. La formation de ces structures dépend au moins en partie des protéines cohésines et CTCF. La formation des TAD et l'organisation des boucles dépendent de facteurs protéiques comme CTCF et les cohésines. En s'associant à l'ADN et en se dimérisant, CTCF de concert avec les cohésines est capable de maintenir rapprochées des régions génomiques distantes. Leurs capacités à lier la chromatine dépend au moins en partie des modifications épigénétiques, comme la méthylation de l'ADN et des histones (H3K27Me3 par exemple). Par conséquent, tout mécanisme influençant les propriétés du paysage chromatinien peut avoir un impact significatif sur l'organisation 3D du génome. En tant que plateformes pour le recrutement de facteurs protéiques, y compris les modificateurs de la chromatine, les lncRNAs sont particulièrement adaptés pour moduler directement la topologie nucléaire. C'est d'ailleurs le cas du lncRNA Firre, qui, en liant la protéine hnRNPU, rapproche topologiquement des loci localisés sur des chromosomes différents, favorise le rapprochement du chromosome X inactif près du nucléole et maintient les marques H3K27me3. De plus, le lncRNA CCAT1-L interagit avec CTCF, favorisant son recrutement à la chromatine et induisant la formation de boucles enhancer-promoteur au niveau du locus MYC dans les cellules HCT116. Sur la base des données bibliographiques et de celles générées par le groupe, nous avons donc décidé d'évaluer si ANRIL pourrait impacter également l'organisation 3D du génome. Pour cela, des expériences de purification des RNP par chromatographie d'affinité ont été réalisées en utilisant des fragments d'ANRIL et la présence de CTCF a été examinée par WB. Comme le montre la Figure 4A, ces expériences ont mis en évidence la présence significative de CTCF dans les RNP formées avec l'exon 21. Des expériences de Cut&Run ont été réalisées en utilisant un anticorps dirigé contre CTCF et les profils d'occupation génomique de CTCF obtenus avec les lignées sauvages et déplétées pour l'exon 21 ont été comparés. L'analyse des résultats a pu mettre en évidence que l'absence de l'exon 21 affecte la localisation génomique de CTCF au niveau d'un nombre restreint de loci. La Figure 4B en présente un exemple représentatif. L'ensemble de ces résultats suggèrent qu'ANRIL pourrait affecter la topologie nucléaire en facilitant le recrutement de CTCF au sein de la chromatine. Figure 4 cf Projet PDF : La localisation génomique de CTCF semble dépendre au moins en partie de l'exon 21 d'ANRIL. (A) Fractionnement sur gel SDS-PAGE et analyse par WB des RNP formées avec les exons 20 et 21 d'ANRIL. La présence des protéines Ybx1 (contrôle) et CTCF ont été détectées. (B) Exemple représentatif d'une région génomique au sein de laquelle l'occupation de CTCF dépend de l'exon 21. Nous avons ensuite réalisé des expériences de capture de conformation chromosomique HiCHIP. Cette méthode permet de détecter les interactions chromatiniennes au sein du noyau en capturant la conformation des chromosomes par pontage de la chromatine au formaldéhyde, suivi d'un fractionnement par digestion enzymatique. Les extrémités des fragments d'ADN sont ensuite couplées à la biotine, et une ligation par proximité est effectuée pour garantir que seuls les fragments d'ADN liés de manière covalente forment des produits de ligation. La chromatine est ensuite fragmentée par sonication, et les fragments d'intérêt sont immunoprécipités à l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine ou la modification d'histone d'intérêt, selon un protocole standard de ChIP. Les fragments élués subissent ensuite une capture supplémentaire grâce au groupement biotine des espèces chimériques générées par ligation par proximité. Ces fragments sont séquencés, et l'analyse des données permet de déterminer leur origine séquentielle et, par conséquent, leur position dans l'organisation 3D du génome27. Ces expériences préliminaires ont été réalisées en collaboration avec l'équipe de G. Barreto qui a implantée cette méthodologie au laboratoire (IMoPA, Nancy). La Figure 5 présente un exemple de résultat représentatif mettant en évidence que l'absence de l'exon 21 affecte la formation de boucles chromatiniennes impliquant les modifications d'histone H3K27me3 dans les cellules HEK293. Figure 5 cf Projet PDF : ANRIL et modulation de la topologie nucléaire. (A) Stratégie de HiCHIP permettant d'évaluer l'organisation 3D du génome dépendante d'une protéine d'intérêt. (B) Exemple représentatif de 2 loci génomiques dont la topologie nucléaire dépend de la présence de l'exon 21 d'ANRIL [perte (gauche) et gain (droite) de boucles chromatiniennes, respectivement]. II.2 Abondance d'ANRIL et sévérité tumorale Notons que les données présentées précédemment ont été générées en utilisant des cellules HEK293. Ces cellules embryonnaires humaines de rein en plus d'être relativement faciles à manipuler, sont largement utilisées dans le domaine de recherche relatif à ANRIL. Toutefois, l'utilisation de modèles cellulaires plus en lien avec les pathologies associées à ANRIL est une étape incontournable notamment dans le but de mieux comprendre les effets moléculaires d'ANRIL sur l'apparition voire le renforcement de la sévérité tumorale. Afin d'identifier les lignées cellulaires les plus pertinentes, nous avons évalué l'expression d'ANRIL par RTqPCR dans 27 lignées issues de tissus tumoraux, notamment du cancer du poumon (Fig.6). Ces analyses révèlent qu'ANRIL est exprimé dans la majorité des lignées examinées, avec une forte hétérogénéité d'expression, en accord avec les données de la littérature. Par exemple, les cellules NCI-H149 présentent un niveau d'expression d'ANRIL 4700 fois supérieur à celui des cellules A549, qui l'expriment très faiblement. Nous avons ensuite classé ces lignées en deux sous-catégories : le cancer du poumon à petites cellules (SCLC) et le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Le SCLC est considéré comme plus agressif que le NSCLC, avec une croissance et une dissémination plus rapides, souvent vers des organes distants dès le diagnostic. Parmi les 27 lignées analysées, 10 appartiennent à la sous-classe SCLC. De manière intéressante, 8 de ces lignées figurent parmi les 10 lignées présentant les niveaux d'ANRIL les plus élevés (Fig.6). Ces résultats suggèrent fortement que les lignées cellulaires les plus agressives du cancer du poumon expriment de façon substantiel ANRIL, en cohérence avec les données rapportées dans la littérature. Figure 6 cf Projet PDF : Expression d'ANRIL dans le cancer du poumon, classée selon SCLC (cancer du poumon à petites cellules_rouge) et NSCLC (le cancer du poumon non à petites cellules_noir). L'expression d'ANRIL a été normalisée par rapport au taux d'expression de RplpO utilisé comme gène de référence. Les cellules A549 qui expriment très faiblement ANRIL ont été utilisées comme référence. Basé sur les données bibliographiques et celles accumulées par le groupe, nous émettons l'hypothèse suivante : ANRIL module l'expression génique en agissant notamment sur la topologie nucléaire. Dans ce projet, nous proposons donc d'évaluer l'impact direct de l'abondance d'ANRIL sur la topologie nucléaire et son lien avec l'expression génique, en conditions physiologiques et pathologiques. À cette fin, nous utiliserons notamment les lignées cellulaires HEK293 (y compris leurs versions modifiées pour l'expression d'ANRIL), ainsi que des lignées dérivées du cancer du poumon comme par exemple SCLC (NCI-H146), à forte expression d'ANRIL, et NSCLC (A549), à faible expression.

spécialité

Sciences de la Vie et de la Santé - BioSE

laboratoire

IMoPA - Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire